Artykuły

Wolne rodniki to atomy lub cząsteczki zdolne do samodzielnego istnienia mające jeden lub więcej niesparowanych elektronów [G. Bartosz: Druga twarz tlenu, PWN, Warszawa 1995]. Dzięki temu rodniki są nietrwałe, ale bardzo aktywne chemicznie. W organizmach żywych mogą one powstawać w reakcjach enzymatycznych lub spontanicznie. Do lat 70-tych w publikacjach medycznych nie było wielu doniesień o roli i znaczeniu wolnych rodników.
Zmieniły tą sytuację wyniki badań opublikowane przez:

• McCoda i Fridovitcha [Mc Cord, J. M. Fridowitch, J. Biol. Chem. 244, 6049, 1969] wskazujące na istnienie prawie we wszystkich komórkach ssaków dysmutazy ponadtlenkowej (SOD; EC 1.15.1.1), enzymu który katalizuje reakcję dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego;
• Babiora [B. M. Babior, J. Clin, Inwest. 52, 741, 1973], który wykazał powiązane funkcje neutrofili z generacją wolnych rodników;
• Grangera [D. N. Granger, Gastroenterology 81, 22, 1981], który wykazał, że wiele chorób jest związanych z brakiem równowagi pomiędzy mechanizmami wzbudzającymi generację wolnych rodników, a systemami unieszkodliwiającymi je.

Do reaktywnych form tlenu (RFT) należą: tlen singletowy, ozon, rodnik wodoronadtlenkowy, anionorodnik ponadtlenkowy, nadtlenek wodoru, rodnik wodorotlenowy, tlen azotu, dwutlenek azotu, kwas nadtlenoazotawy i jego anion.

Reaktywne formy tlenu mają następujące źródła powstawania:

1. Neutrofile odpowiedzialne za zlokalizowanie procesu zapalnego w organizmie, rozpoznanie, zabicie i strawienie intruza. Neutrofile są wyposażone w dwa systemy zabijania: tlenowo-niezależny i tlenowy, który generuje O_2-•, OH•, ONOO-•. Reaktywne formy tlenu uwolnione z komórek fagocytujących mogą powodować uszkodzenia innych komórek.
2. Łańcuch oddechowy – kilka procent tlenu zużytkowanego przez mitochondria ulega tylko częściowej redukcji, tworząc O_2-•. Ocenia się, że dziennie w normalnych warunkach metabolicznych każda komórka człowieka poddana jest ekspozycji 1010 cząsteczek O_2-•. Dla człowieka o masie około 70 kg oznacza to powstanie 0,15 moli O_2-• dziennie.
3. Oksydazy – enzymy katalizujące reakcje, podczas których generowane są RFT, m.in. oksydaza monoaminowa (MAO) z błon retikulum endoplazmatycznego utleniająca ksenobiotyki.
4. Autooksydacja związków endo- i egzogennych – np. autooksydacja adrenaliny generuje RFT.
5. pH spadek kwasowości przyspiesza uwalnianie związanych z białkami metali grup przejściowych (Cu⁺², Fe⁺²⁺), co zakłóca procesy łańcucha oddechowego na korzyść generacji O_2-•. Obniżenie ph w komórkach niedotlenionych zwiększa szansę przeżycia – paradoks pH).
6. Metale grup przejściowych – kationy żelaza, miedzi i manganu mogą przenosić elektron na biologiczne ważne makrocząsteczki.
7. Synteza eikozanoidów – fesfoliza A2 uwalnia z fosfolipidów kwas arachidonowy, który przez cyklo- i lipooksygenazy przekształcany jest w prostaglandyny, leukotrieny, tromboksany i prostacykliny. We wszystkich tych procesach generowane są RFT. RFT aktywują fosfolipazę A2.

Równie ważny jest nadtlenek wodoru, który mimo, że nie jest wolnym rodnikiem, odgrywa ważną rolę w procesach oksydacyjnych powstawania wolnych rodników (rys.1). (Ze względu na dużą reaktywność rodników ich czasy połowicznego rozpadu są bardzo krótkie, np. O_2-• w 37^oC – 1*10^-6 s, OH• w 37^oC – 1*10^-9 s).

Nadtlenek wodoru powstaje w wyniku redukcji tlenu cząsteczkowego lub w wyniku dysmutacji rodnika ponadtlenkowego przez SOD. Redukowany jest przez katalazę do wody i O2. Czas połowicznego rozpadu jest uzależniony od aktywności katalazy i peroksydazy gluationowej, dlatego jego czas trwania jest na tyle długi, że może przenikać przez błony komórkowe i „wędrować” po całym organizmie.

Największe niebezpieczeństwo dla organizmu stwarza rodnik wodorotlenowy, bowiem reaguje z każdą napotkaną cząsteczką organiczną. Reakcje te mogą mieć różne mechanizmy:

• oddania atomu: OH• + HR → H₂O + R•
• przyłączenia rodnika: OH• + R – CH = CH – R → R – CHOH – C• H – R
• addycji rodników: R• + R• → R – R

Wspólną cechą powyższych reakcji jest podtrzymywanie łańcucha reakcji wolnorodnikowych.

Głównym źródłem rodników hydroksylowych jest reakcja Fentona (rys. 1).

H₂O₂ + Fe⁺²→ OH• + OH- + Fe⁺³

Drugim źródłem rodników hydroksylowych jest reakcja Habera-Weissa, w której katalizatorami są kationy żelaza i miedzi.

O_2-• + H₂O₂ → O₂ + OH• + OH-

Anionorodnik ponadtlenkowy O_2-• powstaje w wyniku jednoelektronowej redukcji tlenu cząsteczkowego. Jest produktem końcowym lub pośrednim wieku reakcji enzymatycznych. Powstaje głównie w łańcuchu oddechowym (rys. 2), w przemianach enzymatycznych katalizowanych przez oksydoreduktazy (oksydazę ksantynową, aldehydową, dihydroorotanową, diaminową, oksydoreduktazę NADPH czyli cytochmom P-450, mieloperoksydazę z leukocytów, samoutlenianie zredukowanych form związków biochemicznych (flawin, chinonów nukleotydów, aminokwasów aromatycznych, pterydyn, ferredoksyny, związków tiolowych, m.in. glutationu, adrenaliny, dopaminy).

Rodnik tlenu azotu powstaje podczas syntezy czynnika relaksacyjnego komórek śródbłonka, czyli tlenku azotu z argininy. W reakcji z anionorodnikiem ponadtlenkowym powstaje nietrwały kwas nadtlenoazotawy, ulegający homolitycznemu rozpadowi tworząc rodnik hydroksylowy. Wolnorodnikowa teoria starzenia się opiera się na sprawności reakcji łańcucha oddechowego, którego wydajność wynosi około 40%. Z powodu złego odżywiania i z upływem lat jego sprawność jest coraz niższa, czego skutkiem jest wzmożona produkcja anionorodników ponadtlenkowych O_2-•, które same inicjują łańcuch reakcji wolnorodnikowych lub z których to powstają rodniki hydroksylowe. Pożywienie ubogie w witaminy B i witaminę K powoduje zaburzenia prowadzące do zahamowania reakcji fosforylacji łańcucha oddechowego określonych komórek. Podobne objawy występują przy braku żelaza stanowiącego składnik enzymów łańcucha oddechowego. Witamina K uczestniczy w syntezie łańcucha oddechowego komórek wątrobowych. W wątrobie przy użyciu rezerw energetycznych powstaje większość białek, w tym protrombina - białko mające wielkie znaczenie dla procesów krzepnięcia krwi.

Podobna sytuacja występuje w przypadku braku witamin B. Pelagra i beri-beri są skutkiem zaburzeń biologicznego utleniania w tkankach szczególnie wrażliwych, do których zalicza się komórki nerwowe i komórki nabłonków oraz gruczołów wydzielania wewnętrznego.

W wyniku reakcji wolnorodnikowych RFT ze związkami organicznymi powstają, związki chemiczne o nieznanej strukturze i własnościach biochemicznych, które mogą być przyczyną powstania wielu patologii. Skutki ich działania przedstawia poniższa tabela:

W organizmach eukariotycznych istnieją mechanizmy ochronne neutralizujące niszczące działanie wszechobecnych RFT. Ich zadaniem jest ciągłe monitorowanie sprawności poszczególnych elementów bariery antyoksydacyjnej, czyli utrzymanie właściwej homeostazy procesów pro- i antyoksydacyjnych.

Poszczególne elementy bariery antyoksydacyjnej można podzielić na dwie grupy:

główne:

• enzymatyczne: dysmutaza ponadtlenkowa (CuZnSOD – cytozol, jądro, osocze, MnSOD – mitochondium), katalaza (FeCAT – peroksyzomy), peroksydaza glutationowa (SeGPX – cytozol, mitochondria), transferaza glutationowa (cytozol);
• metaloproteiny zewnątrzkomórkowe (albumina-Fe, Cu, transferyna-Fe, ceruloplazmina-Cu) i wewnątrzkomórkowe (ferrytyna-Fe, metalotioneina-Cu);
• ząsteczkowe: α-tokoferol, β-karoten, kwas askorbinowy, glutation, ubichinon, moczany, karnozyna, anseryna;

pomocnicze:

• enzymatyczne: dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa, reduktaza, disulfoglutationowa;
• cząsteczkowe: bilirubina, biliwerdyna, cystein, adenozyna, histydyna, kwas liponowy, kwas linoleinowy.

Wszystkie elementy bariery antyoksydacyjnej stanowią o jej zdolności ochrony przed niszczącym działaniem RFT (rys. 3). W każdym z miejsc, gdzie istnieje możliwość powstania RFT są obecne antyoksydanty. W reakcjach enzymatycznych, w których powstają RFT, główne produkty mogą być antyoksydantami, np. w reakcji utlenienia ksantyny do kwasu moczowego. Organizm wytworzył bariery przestrzenne ograniczając propagację reakcji wolnorodnikowych poprzez specyficzne rozmieszczenie wszystkich elementów bariery antyoksydacyjnej w ten sposób aby się wzajemnie uzupełniły. Jeżeli aktywność enzymatycznych elementów bariery antyoksydacyjnej jest nie wystarczająca, a innych jej składników jest za mało pozostaje protekcyjne działanie związków endogennych, głównie witamin: A, E i C jak również flawonoidów.

Witamina C, czyli kwas L-askorbinowy jest najsilniejszym rozpuszczalnym w wodzie antyoksydantem. Neutralizuje ona działanie RFT w płynach ustrojowych, we krwi i płynie poza komórkowym. Kwas askorbinowy jest uważany za najistotniejszy antyoksydant hydrofilowy. Najważniejszym fizjologicznie antyoksydantem hydrofobowym, czyli fazy lipidowej jest α-tokoferol, czyli witamina E. Działanie witamin E i C ma charakter synergistyczny. Askorbinian redukuje rodnik α-tokoferolowy, regenerując witaminę E, sam tworząc rodnik askorbylowy, ulegający dalszej redukcji do kwasu dehydroaskorbinowego. Przy udziale glutationu reduktaza dehydroaskorbinianowa odtwarza pierwotną formę witaminy C.

Pomiędzy witaminami E i A występuje synergizm działania podczas inhibicji mikrosomalnej peroksydacji w hepatocytach. Witamina A jest skutecznym antyoksydantem w sytuacjach dobrego dotlenienia organizmu, natomiast w chwilach niedotlenienia wysoką sprawność antyoksydacyjną wykazuje witamina E. Witamina A zapobiega oksydacji frakcji lipidowych osocza oraz lipidów błon komórkowych. Peroksydacja lipidów prowadzi do uszkodzenia błon komórkowych.

Szybkość utlenienia lipidów zależy od rodzaju tkanki, obecności antyoksydantów i jonów metali grup przejściowych oraz od stężenia tlenu. Przebiega ona przez trzy kolejne etapy: inicjacji, propagacji i terminacji. Proces inicjacji jest atakiem rodnika na trzeciorzędowy atom węgla, (bowiem wiązanie C-H posiada niską energię dysocjacji). Proces ten może być inicjowany np.: przez rodnik wodorotlenowy, szczególnie przy udziale metali przejściowych. Anionorodnik ponadtlenkowy nie jest zdolny do inicjowania procesu utleniania lipidów, bowiem jest nierozpuszczalny w fazie lipidowej. Rodniki z niesparowanym elektronem na atomie węgla reaguje z tlenem tworząc rodniki nadtlenkowe, które biorą udział w dalszych reakcjach (reakcje propagacji) reagując z sąsiednimi cząsteczkami nienasyconych lipidów (rys.4).

Jony metali przejściowych katalizują także rozpad nadtlenków lipidowych:

LOOH + Fe²⁺ → LO• + OH-Fe³⁺

LOOH + Fe³⁺ → LOO• + H+Fe²⁺

Etap propagacji jest hamowany przez konkurujący z nim etap terminacji zachodzący między reaktywnymi formami rodnikowymi:

LOO• + L₁ OO• → LOOL₁ + O₂

LOO• + L₁OO• → LOOL₁

L• + L₁• → L – L₁

Efektem tego procesu jest powstawanie lipidów o rozgałęzionych łańcuchach alifatycznych lub kompleksów białkowo-lipidowych. Rozkład nadtlenków lipidowych prowadzi do powstawania licznych związków, takich jak węglowodory nasycone (etan, pentan, heksan) i nienasycone, aldehydy (nasycone i nienasycone, hydroksyaldehydy), dialdehydy (np. dialdechyd malonowy – MDA). Niektóre z tych związków mogą być przyczyną wystąpienia patologii lub mogą być metabolizowane do innych potencjalnych toksyn endogennych.

Na szczególną uwagę zasługują γ-diketowy, które mogą powodować „sieciowanie” lipidów i białek. Usieciowane przez MDA lipidy znaleziono w błonach krwinek w anemii sierpowatej. Generalnie utlenianie lipidów prowadzi do degradacji lipidów błonowych, co może być wykorzystywane przez organizm jako mechanizm ochronny. U ludzi chorych na nowotwory złośliwe zauważono, szczególnie podczas przerzutów, zwiększone stężenie MDA zarówno w surowicy jak i w moczu, co może wskazywać na wzmożoną działalność obronną neutrofili.

Wolne rodniki prowadzą do powstawania obcych struktur biochemicznych w organizmie. Badania wielu ośrodków naukowych na świecie ukierunkowane są na określanie stopnia uszkodzeń kwasów nukleinowych (np. przez oznaczenie 8-hydroksydeoksyguanozyny) białek (przez oznaczanie bityrozyny) i kwasów tłuszczowych (przez oznaczanie MDA, węglowodorów, diketonów i ich metabolitów). Szczególnie ciekawym kierunkiem badań jest poszukiwanie endogennych toksyn powstających w wyniku przemian biochemicznych, którym ulegają produkty łańcucha reakcji wolnorodnikowych.